Os transposons, também conhecidos como “genes saltadores”, são elementos genéticos capazes de se desprender do DNA e se inserir em outras partes do genoma. Algumas famílias de transposons incluem uma endonuclease programável chamada TnpB, considerada ancestral das enzimas Cas usadas na edição genômica CRISPR-Cas. Equipes de pesquisa do Instituto de Genômica Inovadora têm explorado recentemente a possibilidade de aproveitar a capacidade de salto dos TnpBs como uma nova ferramenta para edição genômica, tanto em humanos quanto em plantas. Como o uso de TnpB como ferramentas de edição genômica é recente, queremos apresentar uma visão geral dos TnpB, como funcionam e como diferem dos editores genômicos CRISPR.
As vantagens de serem pequenos A edição genômica CRISPR tem uma limitação significativa: as enzimas são grandes. Alguns TnpB têm menos da metade do tamanho das enzimas CRISPR-Cas (cerca de 400 aminoácidos em comparação com mais de 1.000), o que significa que não são restringidos por muitas das mesmas barreiras físicas.
Tanto em plantas quanto em animais, a entrega viral é comumente usada para transportar proteínas de edição genética para células específicas. Um problema é que os vírus geralmente têm uma capacidade de transporte limitada e não conseguem transportar de forma confiável sistemas grandes como o CRISPR-Cas, mas os TnpB são mais fáceis de transportar.
Como os TnpB saltam pelo genoma Apesar de suas origens evolutivas compartilhadas, os TnpB operam de maneira muito diferente das enzimas Cas. Para que um transposon se mova pelo genoma, ele deve "saltar" para um novo local, um processo que envolve a excisão de seu local original. Essa excisão é realizada pela TnpA, uma enzima transposase que reconhece o início e o fim do transposon e corta em cada sequência. O transposon excisado pode então se inserir em um novo lócus no genoma, mas a cópia original do transposon deve ser restaurada.
Otimizando editores TnpB para uso prático A capacidade dos TnpB e seus guias de reRNA de reconhecer motivos específicos e realizar cortes precisos e programáveis é o que impulsiona seu potencial como uma nova ferramenta na edição genômica. No entanto, como a atividade de endonuclease guiada por RNA do TnpB só foi caracterizada experimentalmente em 2021, este campo permanece recente. Assim, os TnpB ainda não foram otimizados para alta eficiência de edição o suficiente para competir com outros sistemas, como o CRISPR-Cas. Brittney Thornton e Rachel Weissman, dos laboratórios de Savage e Doudna no IGI, são duas das pesquisadoras que trabalham para aprimorar os sistemas TnpB para implementação na biotecnologia moderna. Em um novo artigo na Nature Biotechnology, a equipe de pesquisa avaliou os efeitos da alteração de cada aminoácido individual do TnpB por meio de varredura mutacional profunda (DMS).
Mutações favoráveis foram identificadas usando bibliotecas de DMS de TnpB, abrangendo quase todas as substituições de aminoácidos individuais na proteína e mutações de nucleotídeos individuais no reRNA. Essas bibliotecas de variantes agrupadas foram transformadas em uma cepa repórter de levedura, e o desempenho de cada variante foi medido programando a TnpB para reparar um gene essencial, com base em um ensaio previamente utilizado para aprimorar o CRISPR-Cas9. As células de levedura editadas conseguem sobreviver e formar colônias, enquanto as células não editadas não proliferam. Ao sequenciar o DNA das colônias que cresceram, os pesquisadores contaram quantas vezes cada variante apareceu nas células de levedura editadas. Ao comparar os mutantes de TnpB com a TnpB não modificada (WT), as mutações podem ser associadas a um efeito positivo ou negativo na atividade.
A análise por DMS revelou os efeitos, tanto positivos quanto negativos, da alteração de cada aminoácido individual, permitindo que os pesquisadores identificassem padrões de desempenho.
“Estávamos prestes a realizar esse grande ensaio de triagem e queríamos ser muito rigorosos na interpretação dos efeitos mutacionais”, explica Thornton, coautor do estudo. Ter um bom entendimento da estrutura bioquímica permitiu que eles garantissem que seus resultados fizessem sentido e que as mutações enriquecidas fossem racionais. O estudo da forma física do reRNA TnpB revelou uma região que os pesquisadores denominaram "dobradiça", hipotetizada como reguladora do estado ativo do TnpB. Isso fornece uma possível explicação para o enriquecimento de mutações na "dobradiça" no DMS: alterações nessa região podem deixar o TnpB em um estado livre para realizar mais edições. Além de aumentar a confiança nos resultados, essa base sólida permitiu que os pesquisadores formulassem hipóteses sobre outras mutações de ganho ou perda de função. Notavelmente, 20% das mutações de um único aminoácido resultaram em um aumento na atividade em comparação com o TnpB selvagem. Considerando o papel do TnpB como uma endonuclease associada a transposons, faz sentido que a evolução possa estar selecionando contra variantes altamente ativas: quebras excessivas de fita dupla não são vantajosas se comprometerem a aptidão do hospedeiro. Um transposon hiperativo corre o risco de interromper genes essenciais, o que prejudicaria seu hospedeiro, reduzindo seu sucesso evolutivo — mas essas variantes poderiam ser valiosas como ferramentas de edição genômica.
A partir de sua biblioteca de mutações, os pesquisadores selecionaram 33 das melhores mutações de reRNA e as combinaram para criar cerca de 5 mil mutantes de TnpB. Após mais ensaios em levedura, cinco dos melhores mutantes foram selecionados para testes adicionais em plantas, utilizando o organismo modelo Nicotiana benthamiana. Todas as variantes exibiram eficiências de edição de 4 a 40 vezes maiores que a do TnpB selvagem (WT).
Em conjunto com o reRNA selvagem, os dois melhores mutantes de TnpB superaram outras endonucleases pequenas de RNA projetadas para edição em N. benthamiana e foram posteriormente utilizados em um segundo estudo em colaboração com o laboratório de Dinesh-Kumar na UC Davis, publicado recentemente na Nature Plants. Utilizando esses mutantes aprimorados para edição genômica em N. benthamiana, os pesquisadores descobriram que a variante eTnpBc foi particularmente eficaz, atingindo até 90% de eficiência de edição em locais específicos do genoma. Além disso, esse método de edição genômica é totalmente livre de transgenes, o que significa que nenhum DNA exógeno é inserido no genoma.
Este avanço demonstra o potencial da pesquisa sobre TnpB, tanto em suas capacidades atuais quanto na habilidade dos cientistas em impulsioná-la. Ao adaptar as ferramentas da natureza às necessidades da humanidade, este campo fascinante promete expandir o conhecimento humano e, ao mesmo tempo, criar novas possibilidades.
